1、光度法測定的條件：分光光度法測定物質含量時應注意的條件主要是顯色反應的條件和測定吸光度的條件。顯色反應的條件有顯色劑的用量，介質的酸度、顯色時溫度、顯色時間及干擾物質的消除方法等；測量吸光度的條件包括入射光波長的選擇、吸光度范圍和參比溶液等。

 

2、二氮雜菲-亞鐵絡合物：鄰二氮雜菲是測定微量鐵的一種較好的試劑。在pH=2～9的條件下Fe2+離子與鄰二氮雜菲生成穩定的橘紅色絡合物，此絡合物的lgK穩=21.3,摩爾吸光系數ε510=1.1×104在顯色前，首先用鹽酸羥胺把Fe3＋離子還原為Fe2＋離子，其反應式如下：2Fe3＋+2NH2OH·HCl→2Fe2＋+N2+2H2O+4H++2Cl-測定時，控制溶液酸度在pH=5左右較為適宜。酸度過高，反應進行較慢；酸度太低，則Fe2+離子水解，影響顯色。Bi3+，Cd2+，Hg2+，Ag+，Zn2+等離子與顯色劑生成沉淀，Ca2+，Cu2+，Ni2+等離子與顯色劑形成有色絡合物。因此當這些離子共存時，應注意它們的干擾作用。

 

二、分光光度計測定微量鐵試劑

 

    10µg/mL的鐵標準液；鹽酸羥胺固體及10%溶液（因其不穩定，需臨時用時配）；0.1%鄰二氮雜菲（新配制）；1mol/LNaAc溶液。

 

三、標準鐵的制備

 

    稱取0.7022g硫酸亞鐵銨[Fe(NH4)2(SO4)2•6H2O],溶于70ml硫酸溶液中,滴加0.02mol/L的高錳酸鉀溶液至出現微紅色不變,用純水定容至1000ml。此貯備溶液1.00ml含0.100mg鐵。

 

四、指示劑的選擇

 

    原則指示劑也有酸堿性，指示劑一般是有機物，酸堿濃度太大有可能破壞指示劑（少數），而且濃度太高你每一滴里的酸堿就多，不可能恰好滴合適的酸堿，總是要多半滴，濃度越高差的越多是根據所需要的PH值的確定的，其值在所選擇的指示劑的突越范圍內。這樣溶液才能夠有顏色的變化，才能夠判斷終點。

 

五、步驟

 

1、吸收曲線的繪制準確

 

   移取10µg/mL鐵標準溶液5mL于50mL容量瓶中，加入10%鹽酸羥胺1mL，搖勻，稍冷，加入1mol/LNaAc溶液5mL和0.1%鄰二氮雜菲3mL，以水稀釋至刻度，在分光光度計上，用1cm比色皿，以水為參比溶液，用不同的波長從430nm開始到570nm為止，每隔10nm或20nm測定一次吸光度。然后以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制吸收曲線，從吸收曲線上確定該測定的適宜波長。

 

2、鐵含量的測定

 

（1）標準曲線的繪制：取50mL容量瓶（或比色管）6支，分別移取2mL、4mL、6mL、8mL，鐵標準溶液于5支容量瓶中，另一容量瓶中不加鐵標準溶液（配制空白溶液，作參比）。然后各加入1mL10%鹽酸羥胺，搖勻，經2min后，再各加5ml1mol/LNaAc溶液及3ml0.1%鄰二氮雜菲，以水吸稀釋至刻度，搖勻。在分光光度計上，用1cm比色皿，在大吸收波長（510nm）處，測定各溶液的吸光度。以鐵含量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

 

（2）未知液中鐵含量的測定：分別二次吸取10mL未知液代替標準溶液，其它步驟均同上，測定吸光度。由未知液的吸光度在標準曲線上查出10mL未知液中的鐵含量，然后以每毫升未知液中含鐵多少微克表示結果。

 

3、繪制吸收曲線

 

六、未知鐵量的測定  

 

    測的各標液的吸光度，畫標準曲線；再根據未知鐵液的吸光度，在標準曲線上找出對應的鐵量，進而求未知溶液中鐵的含量。

 

七、微量分光光度計的使用  

 

    分光光度法測量的理論依據是朗伯-比耳定律：當一束單色光通過一定濃度的稀有色容液時，溶液對光的選擇吸收程度A與溶液的濃L度或液層成正比即A=kcL=log(I0/I),式中：A為吸光度，表示光通過溶液時被吸收的強度；為有色溶液的濃度；I0為入射光強度；I為透射光強度；L為液層的厚度；為k吸光系數，它與入射光的波長及溶液的性質、溫度等有關。當入射光強度I0、吸光系數k和溶液厚度L不變時，透射光強度I只隨溶液中物質的量C而變化。因此，如果把通過溶液的光線通過測光機構中的光電轉換接受器，并轉換成電能，在微電計上就讀出相應的透光率，從而推算出溶液濃度。        

 

八、微量分光光度計使用注意事項

 

1、儀器預熱后，開始測量前反復調透光率0%和透光率100%。

2、儀器連續使用不應超過2h，否則，好間歇0.5h后再使用。

3、比色皿洗滌必須干凈，拿取比色皿時，只能用手捏住毛玻璃的兩面，裝待測液時，應用待測液潤洗2-3次，保證待測液濃度不變，倒入的溶液應在2/3-3/4處而不要太滿，放時應將透光面對著光路。

4、比色皿要根據溶液顏色的深淺選擇厚度。

5、實驗完后用的洗滌液以及蒸餾水洗凈晾干后存放在比色皿盒內，不能用堿溶液和強氧化劑洗滌以免腐蝕玻璃或使比色皿粘接處脫膠。

6、測量時好從低濃度到高濃度進行，這樣可減少誤差。